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    病毒RNA提取實(shí)驗(yàn)方法

    發(fā)布時(shí)間: 2010-03-26  點(diǎn)擊次數(shù): 3069次

    1,用異硫氰酸胍提取
    提禽流感病毒的詳細(xì)步驟,可參考(我提過N次做定量PCR都沒問題):
    1.取200ul樣品數(shù)+陰性對照+陽性對照個(gè)1.5ml滅菌eppendorf管
    2.加600ul異硫氰酸胍,然后加入對照和樣品,再加200ul氯仿,顛倒混勻
    3.13000rpm離心15min
    4.在第3步離心快結(jié)束時(shí),另取同樣多eppendorf管,加入400ul -20度預(yù)冷的異丙醇
    5.取第3步離心的上清(一定不要吸取到中間白色層,第3步離心結(jié)束往外拿的時(shí)候,管子盡量不要傾斜)轉(zhuǎn)移到第4步準(zhǔn)備的管中,顛倒混勻
    6.13000rpm離心15min,輕輕倒去上清;在吸水紙上盡量沾干液體
    7.加600ul 75%乙醇,顛倒數(shù)次以洗滌殘存異丙醇
    7.13000rpm離心15min,輕輕倒去上清;在吸水紙上盡量沾干液體
    8.4000rpm離心10sec,將管壁殘存液體甩到底部,用微量槍頭吸干,室溫干燥2-3min(不可過分干燥,防止下一步RNA不溶解)
    9.加入20ul DEPE水(加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水),輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5sec,冰上保存?zhèn)溆茫?小時(shí)內(nèi)使用,以免RNA降解)

    2,用TRIzol LS提取
    應(yīng)用TRIzol LS提取病毒RNA
    所提取物為血清、血液、細(xì)胞培養(yǎng)液、雞胚尿囊液等液體中的病毒。提取時(shí)盡量在人少時(shí)進(jìn)行,防止空氣中RNA酶的污染。所用一切物品也應(yīng)是無RNA酶的。
    1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul,再加入TRIzol LS 500ul,充分混勻,室溫放置10min。
    1.2 加入200ul的氯仿,蓋緊離心管蓋,用力震蕩離心管(溶液充分乳化,成乳白狀,無分相現(xiàn)象),室溫放置10min (由于氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā),振蕩時(shí)離心管可能爆開,小心)。
    1.3 離心 4℃、13000r/min、15min,取上層液相移入另一管(切忌吸動(dòng)白色中間相)。
    1.4 加入等體積異丙醇,輕輕顛倒離心管充分混勻液體,室溫放置10min。
    1.5 離心 4℃、13000r/min、15min,(這時(shí)乍一看會(huì)發(fā)現(xiàn)管子里好像沒有東西,再仔細(xì)看看,會(huì)發(fā)現(xiàn)靠近管底的壁上有一星點(diǎn)的白色沉淀物,就是它了)用槍小心吸去所有上清。
    1.6 1ml75%乙醇洗一遍,離心 4℃、8000r/min、10min,(這時(shí)又會(huì)發(fā)現(xiàn)管子沒東西了,不要擔(dān)心,有的,但是因?yàn)榱刻倏床灰娏T了)用槍小心吸去所有上清,在超凈臺(tái)中干燥5min。
    1.7 加入適量DEPC處理水。(如果材料來源豐富的話,加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量;若要省著點(diǎn)用,則自己看著辦了,盡量不要加太多的水)。
    1.8 建議立即做RT。若要保存,可在上一步加入乙醇后凍存于-70℃,可保存一年;若加入DEPC水后則只能在-20℃保存1個(gè)月左右。

    3,Trizol法提禽流感病毒protocol
    Trizol法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌,樣品量從幾十毫克至幾克。
    1、 取雞胚尿囊液,加入5-10倍體積 Trizol液,混勻;
    2、 室溫放置5分鐘,然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈搖蕩離心管15秒;
    3、 取上層水相于一新的離心管,按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇,室溫放置10分鐘,12000g離心10分鐘;
    4、 棄去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,混勻,4℃下7500g離心5分鐘;
    5、 重復(fù)第4步;
    6、 小心棄去上清液,然后室溫干燥5-10分鐘,注意不要干燥過分,否則會(huì)降低RNA的溶解度;
    7、 然后將RNA溶于水中,放置10分鐘。

    [注意]
    1、 整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套,并盡可能在低溫下操作。
    2、 加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個(gè)月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年
     

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